01什么是瞬時轉染？

簡單說，就是把外源質粒（比如帶熒光的載體）導入細胞，讓質粒在細胞內臨時表達（通常24-72h達到峰值），不用整合到細胞基因組，主打一個“快速出結果”。

02哪些質粒能做瞬時轉染？

不是所有質粒都能瞬轉，重點看「真核表達元件」

常用瞬轉載體（直接用）：

熒光載體：pEGFP-N1/C1、pLVX-mCherry-C1、pIRES2-EGFP、pDsRed2-Mito通用載體：pcDNA3.1系列、pCMV-HA、pEF-GFP慢病毒載體（兼容瞬轉）：pLVX系列、pCDH系列（既能瞬轉，也能后續穩轉）

不能瞬轉的載體：

pET、pGEX、pUC、pBlueScript等原核表達/克隆載體（沒有真核啟動子，轉進去也不表達）

03實操重點

1. 細胞鋪板：轉染前24h鋪板，密度控制在70%-80%；2. 細胞換液：換成無抗生素培養（抗生素會影響細胞攝取質粒），血清濃度在5%-10%的培養基。細胞狀態越好，轉染效率越高；3. 質粒準備：DNA量控制在2-6μg（黃金范圍）；4. 轉染液配制：注意輕柔配置；5. 轉染：將100μL轉染液和DNA復合物逐滴（1滴2-3s）加入孔板，輕輕搖勻；6. 換液：37℃、5%CO?孵育4-6h后，然后吸棄轉染液，PBS洗1次，換新鮮完全培養基；7. 熒光檢測：轉染后24-48h熒光最強。

04高頻避坑指南（新手必看）

1.  無熒光/熒光弱？→ 大概率是HBS pH不準（重新校準到7.05-7.15），或質粒不純（A260/A280≈1.8最佳），或細胞密度太低。

2.  細胞大量死亡？→①　孵育時間過長、②　Ca2?濃度過高、③　細胞生長狀態不好④　質?？偭砍^6μg

解決方案：①　減少孵育時間至4h，②　降低DNA用量。③　此外，磷酸鈣轉染時，注意混合要緩慢滴加（1滴2-3s）,輕柔渦旋，再靜置15-20min，避免靜置時間過長生成沉淀，難進入細胞。

3.  雙標只有一個亮？→ 質粒比例失衡，調整兩個質粒用量（1:1），確保兩個質粒都能被細胞攝取。

05實驗總結

瞬時轉染的核心的是「細胞狀態+質粒質量+操作精度」，不用追求復雜試劑，磷酸鈣法低成本也能出好結果；雙質粒共轉只要控制好總DNA量和比例，就能輕松實現。

明美活細胞成像儀MCS22的熒光效率模塊，應用于熒光轉染分析：